Resumen: El laboratorio de Richard Axel se interesa en cómo la información sensorial se representa en el cerebro. Las neuronas sensitivas olfativas que expresan un receptor dado se proyectan a lugares espacialmente constantes del cerebro para crear un mapa topográfico de la información olfativa. Estudios recientes sugieren que el receptor del olor define la identidad funcional de la neurona sensitiva así como también su objetivo en el cerebro. Por lo tanto el mecanismo de selección del receptor es esencial en la formación y funcionamiento de la representación olfativa del cerebro.
Todos los eucariotas han desarrollado un mecanismo para reconocer la información olfativa del ambiente y transmitirla al cerebro, donde luego ésta debe ser procesada para crear una representación interna del mundo externo. Esta representación del mundo sensorial en el cerebro posteriormente traduce las características del estímulo a un código neural que permite la discriminación de una compleja información sensorial. Nuestra investigación se basa en la naturaleza de este mapa sensorial – cómo se constituye durante el desarrollo, cómo puede cambiar con la experiencia olfativa, y fundamentalmente cómo es leído para producir pensamientos y conductas adecuadas.
La naturaleza del mapa sensorial en los mamíferos
La percepción olfativa requiere tanto del reconocimiento de un repertorio diverso de moléculas olorosas en la periferia y mecanismos más centrales que permiten la discriminación de los olores. En ratones, el reconocimiento de los olores del ambiente es suministrado por una gran familia de moléculas receptoras odorantes que son codificadas estimativamente por 1.500 genes. Sin embargo, la discriminación de la información olfatoria, requiere de mecanismos neurales que son capaces de diferenciar cuál de los numerosos receptores ha sido activado por un odorante dado. En ratones, cada una de los 2 millones de neuronas sensoriales olfatorias expresa solamente 1 de los aproximadamente 1.500 genes receptores odorantes, de un solo alelo. Aunque están aleatoriamente distribuidas en el epitelio dentro de uno de cuatro zonas amplias pero circunscriptas, las neuronas que expresan un receptor dado proyectan sus axones con precisión hacia dos estructuras sinápticas discretas, o glomérulos, dentro de bulbo olfativo. El patrón de proyecciones es espacialmente constante, brindando una representación bidimensional de la activación del receptor en el cerebro. Los estudios con obtención de imágenes demuestran que diferentes olores producen patrones definidos de activación glomerular, revelando una representación funcional del mapa anatómico. Por lo tanto, la calidad de un odorante puede reflejarse por diferentes patrones de actividad espacial, primero en el bulbo olfatorio y finalmente en centros más elevados del cerebro.
La observación de que neuronas sensoriales individuales expresan solamente un solo gen receptor es un componente central de este modelo de percepción olfatoria. La naturaleza molecular del receptor odorante expresado por una neurona sensorial específica definirá la naturaleza de los olores a los cuales esta célula puede responder, y por lo tanto su identidad funcional. Una vez que el receptor es seleccionado, éste también sirve como molécula guía que dirige las proyecciones específicas de esta neurona hacia el cerebro, estableciendo finalmente un mapa sensorial. El rol central de la expresión del receptor inmediatamente genera la pregunta sobre qué mecanismo se ha desarrollado para asegurar la expresión de solamente 1 de 1.500 genes receptores en la neurona sensorial.
El mecanismo de selección del receptor
Un modelo para el control de la expresión del receptor olfativo (RO) recurre a la existencia de más de 1.000 tipos de células diferentes, cada una expresa una combinación única de factores reguladores que dirigen la selección de un gen RO diferente. Este modelo determinista predice que todos los genes RO contendrán diferentes secuencias reguladoras cis que son reconocidas por diferentes grupos de factores de transcripción. Una alternativa, el modelo estocástico de selección del gen receptor sugiere que todos los genes receptores odorantes dentro de una zona contienen la misma información reguladora cis y son controlados por el mismo grupo de factores de transcripción. En este modelo, debe existir un mecanismo especial para asegurarse que solamente un gen receptor se exprese de solamente uno de los dos alelos de una neurona dada. Sin embargo, una vez que se ha seleccionado un receptor específico para expresarse, esta selección transcriptiva debe ser estable para la vida de la célula porque el cambio de receptor luego de la formación de una sinapsis estable perturbaría severamente la discriminación del olor.
Hemos concebido una estrategia genética que nos permitiera examinar la estabilidad de la expresión del receptor. Observamos que la mayoría de las neuronas que han elegido un receptor específico continúan expresando este receptor durante la vida de la célula. Sin embargo, una subpoblación de células cambia la selección del gen receptor. Las células que inicialmente transcriben un receptor mutante cambian con mucha mayor probabilidad y finalmente expresan en forma estable un gen receptor funcional. Estas observaciones sugieren un mecanismo de selección de gen RO en la cual una célula selecciona solamente un alelo del receptor pero puede cambiar a baja frecuencia. La expresión de un receptor funcional probablemente provoca una señal que suprime el cambio y estabiliza la expresión del receptor odorante. Las neuronas que inicialmente expresan un receptor mutante no reciben esta señal y cambian de genes hasta que se selecciona un receptor funcional. Este modelo de monogamia seriada asegura que las neuronas expresen un único receptor durante toda su vida.
La demostración del cambio de receptor también brinda una idea del mecanismo por el cual las células expresan solamente un único gen RO. Las células que expresan un gen receptor odorante mutante cambian y expresan el repertorio completo de genes RO de tipo desordenado permitido en una zona dada. Esta observación es compatible con un modelo estocástico en el cual un grupo común de factores reguladores reconoce características de control compartidas por todos los genes RO. Esta maquinaria reguladora común puede ser desplazada de un promotor del receptor y activa un segundo gen RO para lograr el cambio. La selección estocástica de un único gen RO producirá la expresión de un repertorio completo de receptores por un grupo limitado de factores reguladores compartidos por todas las neuronas sensoriales olfatorias.
Ratones clonados de neuronas sensoriales olfatorias
Un mecanismo para asegurar la expresión de solamente un receptor en una célula podría involucrar eventos de reordenamiento del ADN que introducen genes receptores en un único lugar de expresión activo en el cromosoma. Hemos encarado el problema del reordenamiento del gen receptor generando ratones clonados que derivan del núcleo de una neurona sensorial olfatoria que expresa un receptor odorante dado. Debido a la ineficiencia de clonar por transferencia nuclear, es difícil identificar con certeza el origen del núcleo donante que contribuye a la generación de un animal clonado. Una solución experimental a este problema es emplear células donantes cuyo ADN esté reordenado en forma única. Por lo tanto hemos generado ratones en los cuales ocurre un reordenamiento específico del ADN solamente en las neuronas sensoriales olfativas maduras de manera que este reordenamiento pueda ser identificado en los clones, sin ambigüedad demostrando la derivación del núcleo odorante de las neuronas sensoriales olfatorias.
Las neuronas olfatorias que expresan un receptor dado fueron genéticamente marcadas para expresar la proteína fluorescente verde (PFV). Se identificaron las neuronas sensoriales que expresaban PFV, y sus núcleos fueron aislados para transferirlos a oocitos enucleados. Se permitió el desarrollo in vitro de estos oocitos genéticamente manipulados a la etapa de embrión blastocisto, y se obtuvieron líneas de células madre embrionarias. Estas células madres embrionarias clonadas (células ME) luego se inyectaron en blastocistos tetraploides para efectuar la prueba más rigurosa de la potencia de desarrollo. La complementación del embrión tetraploide genera un feto en el cual todos los linajes embrionarios derivan de las células ME inyectadas.
Estas líneas de células ME derivadas por transferencia nuclear produjeron múltiples ratones vivos que no exhibieron fenotipos anatómicos o de comportamiento evidentes. El patrón de expresión de los receptores olfativos en ratones clonados fue indiferenciable de aquel observado en animales controles. Además, efectuamos transferencia de proteínas «Southern blotting», reacción en cadena de la polimerasa (RCP), y secuenciamiento del genoma para examinar la organización de los genes receptores odorantes en el cromosoma de los ratones clonados en un esfuerzo por detectar los eventos de reordenamiento potencial del ADN. Estos experimentos demuestran que no existen cambios irreversibles en el ADN que acompañen la selección de los genes receptores odorantes. Generalmente, revelan que el núcleo de una neurona sensorial olfativa post-mitótica puede reingresar al ciclo celular y sufrir una reprogramación para dirigir el desarrollo totipotencial de un ratón.
Si la expresión del gen receptor odorante no es mediada por el reordenamiento del ADN, ¡Cómo hacen las neuronas sensoriales maduras para activar un único gen receptor odorante? Un modelo postula la existencia de un proceso cinéticamente lento limitado por los componentes de un aparato transcriptivo especializado de manera que solamente un gen tiene la posibilidad de estar activo en una célula dada. Este modelo también recurre a un solo lugar activo, no en el ADN sino en forma de un aparato transcriptivo que puede activar en forma estable solamente uno de los 1.500 genes receptores olfativos.
Web: www.hhmi.org
Traductora: Liliana Storino.
E-Mail: lilianastorino@arnet.com.ar
Fuente: Howard Hughes Medical Institute.
